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Background

  在自然界中，光照強(qiáng)度時刻處于動態(tài)波動狀態(tài)，波動光（Fluctuating light, FL)脅迫一直是藍(lán)藻、微藻光合生長的重要制約因素。劇烈光強(qiáng)起伏會破壞光合系統(tǒng)、引發(fā)光抑制，不僅影響藻類天然生長，更嚴(yán)重限制了光生物反應(yīng)器工程藻株培育、光合機(jī)理研究與作物耐逆育種挖掘。盡管已有關(guān)于關(guān)鍵FL耐受性組分的研究報(bào)道，但其遺傳機(jī)制等仍未明確：

? 已發(fā)現(xiàn)部分基因、蛋白參與波動光響應(yīng)，但缺乏可應(yīng)用的優(yōu)良耐受等位基因；

? 傳統(tǒng)培養(yǎng)方式無法精準(zhǔn)模擬梯度波動光，難以開展長期適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化（ALE）；

? 常規(guī)檢測手段只能測生長量，無法快速無損評估光合系統(tǒng)活性、篩選表型變異菌株；

? 恒定強(qiáng)光與波動光耐受機(jī)制完全獨(dú)立，普通培養(yǎng)和檢測體系難以區(qū)分兩類脅迫表型。

Solutions from Ecotech

  在實(shí)驗(yàn)室尺度，如何精準(zhǔn)模擬自然波動光環(huán)境、實(shí)現(xiàn)藻類長期馴化培養(yǎng)？如何高通量篩選光合表型差異菌株、解析光耐受生理機(jī)制？這就不得不借助一些專業(yè)的科研設(shè)備：

• 藻類培養(yǎng)與在線監(jiān)測技術(shù)
• LED光源精準(zhǔn)調(diào)控，單個或多種光質(zhì)、光強(qiáng)無極調(diào)控，自定義光照程序
• 環(huán)境參數(shù)控制：溫度、通氣、pH、濁度可控
• 實(shí)時監(jiān)測生長曲線（OD）
• 實(shí)時監(jiān)測葉綠素?zé)晒?、pH、溶解氧等
• 不同通道數(shù)、不同規(guī)模高通量培養(yǎng)：同步培養(yǎng)1到多個通道，容積從100mL到數(shù)十升

• 葉綠素?zé)晒鉁y量與成像技術(shù)
• 無損測量藻類熒光參數(shù)，靈敏反映光合活性
• 多場景應(yīng)用，便攜式、臺式、顯微鏡式等型號，滿足各類場景需求
• 熒光成像系統(tǒng)高通量測量，可同時測96wells
• 多種內(nèi)置測量程序，兼?zhèn)湔{(diào)制式、非調(diào)制式測量功能
• 參考文獻(xiàn)眾多，數(shù)據(jù)、圖像可直接發(fā)文章

Typical case

  接下來，我們以Nature Communications最新發(fā)表的文章（Improving tolerance to fluctuating light through adaptive laboratory evolution in the cyanobacterium Synechocystis）為案例，從實(shí)際研究出發(fā)，詳解易科泰藻類培養(yǎng)與研究技術(shù)的應(yīng)用。

先說結(jié)論：

  本研究通過在兩種FL條件下（其中一種對起始菌株具有致死性，記為LT）對集胞藻PCC 6803進(jìn)行進(jìn)化改造，依靠標(biāo)準(zhǔn)化藻類馴化培養(yǎng) + 光合熒光表型精準(zhǔn)監(jiān)測全套技術(shù)，篩選出Pam68、RpaB、Sll0518 三大關(guān)鍵突變基因，其中Pam68（PSII 組裝蛋白）和Sll0518基因突變可增強(qiáng)對非致死性FL的耐受性；而RpaB（藻膽體結(jié)合調(diào)節(jié)因子B）的功能獲得性缺失突變則顯著增強(qiáng)了對致死性FL及強(qiáng)光條件的耐受性。

• 實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性進(jìn)化，高效選育FL耐受菌株

ALE：指在實(shí)驗(yàn)室條件下通過人為選擇壓力促使微生物（如聚球藻屬）逐步進(jìn)化獲得特定性狀（如高光耐受性）的研究方法。本研究中設(shè)計(jì)了FL0、FL +兩套方案，歷時 20 個月、20 輪培養(yǎng)，對聚球藻進(jìn)行了兩種波動光方案下的ALE處理，過程依托 MC1000 8通道藻類培養(yǎng)與在線監(jiān)測系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)高精度控制。

• 單克隆高通量初篩分型

  對馴化的培養(yǎng)物接種于固體培養(yǎng)基并在恒定LL20光照條件下培養(yǎng)，隨后分離出單個克隆并培養(yǎng)，之后對單克隆菌落，利用FluorCam葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)進(jìn)行原位熒光成像，測定PSII 量子產(chǎn)率 Fv/Fm。依托該功能，從百余個克隆中篩選出覆蓋表型多樣性的通過對12株FL0和12株FL+單克隆菌株并進(jìn)行全基因組分析（以這些適應(yīng)性菌株的來源菌株LT以及原始可運(yùn)動型集胞藻PCC 6803菌株[標(biāo)記為“WT”]作為對照），獲得了含412個突變的突變矩陣。大幅降低測序成本、提升篩選效率。

• 共有突變基因—Pam68功能鑒定

為驗(yàn)證基因功能，對Pam68過表達(dá)菌株（pam68oe），Pam68_S113G，pam68基因敲除突變體（ins0933）h在LL12和FL0final培養(yǎng)條件下進(jìn)行比較（下左圖）

為評估該S→G突變在不同物種中的適應(yīng)潛力，在集胞藻LT和ins0933菌株中分別表達(dá)了野生型AtPAM68（AtPAM68WT）和AtPAM68S174G，并在LL50、HL700及FL0final條件下觀察其生長情況。（下右圖）

以上菌株的培養(yǎng)也在MC1000中完成，再次證明了這套系統(tǒng)在藻類全測量培養(yǎng)和研究階段的重要作用。

• 特異突變基因—rpaBT183P功能鑒定

   利用FluorCam葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)，對rpaBT183P突變菌株進(jìn)行非光化學(xué)熒光淬滅測量，以鑒定基因在光系統(tǒng)結(jié)構(gòu)功能方面的作用。結(jié)果表明rpaBT183P對光系統(tǒng)化學(xué)計(jì)量比及外周天線結(jié)構(gòu)的積累具有差異性影響：該基因通過下調(diào)藻膽體捕光容量、調(diào)控狀態(tài)轉(zhuǎn)換、重塑PSI/PSII化學(xué)計(jì)量比、提升CEF（環(huán)式電子傳遞）活性實(shí)現(xiàn)光保護(hù)，且存在低光生長與強(qiáng)光耐受的權(quán)衡。

recommendation

易科泰提供藻類培養(yǎng)與研究檢測技術(shù)方案

• 微藻及大型藻類測量研究、培養(yǎng)與在線監(jiān)測技術(shù)
• 藻類葉綠素?zé)晒鉁y量與葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)
• 藻類光譜測量與光譜成像技術(shù)
• 藻類表型成像分析技術(shù)
• 光養(yǎng)生物反應(yīng)器技術(shù)